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定量核磁在药物研究中的应用

发布时间: 2020-5-9    浏览次数: 28

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在药物研发中,核磁共振(NMR)技术在药物定性研究(结构确证)方面的应用已经非常成熟。而近些年,随着核磁共振定量技术的发展,定量核磁(QNMR)在药物定量研究中也发挥了至关重要的作用。


早在2000年前,QNMR就已经被收录入USP、EP、JP等各国药典中,但国内一直对该技术没有明确说明,直到2010版中国药典将该方法收入附录中,明确了QNMR方法的合规性,并对该方法进行了详细的说明(参照0441),并提出了相对定量和绝对定量的概念


依据药典定义,QNMR方法应用主要分为绝对定量与相对定量2种。在常规药物分析中,如果是做主成分/杂质定量,一般用绝对定量法。绝对定量法又分为内标法和外标法两种,因为内标法比较常用,所以药典主要对内标法的原理做了一定阐述,即内标峰和样品定量峰的峰面积比等于内标峰与定量峰的物质的量之比;如果测定药物内多组分同时测定,且各个组分不易分离,多用相对定量法。药典整个指导原则主要是针对氢核定量,该方法在国内多用于对照品标化。

2015年中国药典对该方法进行了补充,提出了QNMR法的实验过程中要注意关键参数的设置优化,配制浓度、溶解度、相位、基线校正等。具体方法验证怎么做,中国药典0441里没有具体提及。这个可以参考国外药典,具体以USP(761项)为例。



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USP里规定了QNMR实验,必须满足延迟时间d1(延迟时间)≥5T1,这主要是为了让原子达到完全驰豫,目前有2种优化方式比较常用,一种是进行驰豫实验(T1考察),形成大数据最终筛选出合适的d1,一种是依据经验,对不同的d1进行考察,比如分别设置为2、5、10、20、40s,通过峰面积比的RSD确定最终参数。除了d1外,一般做QNMR时也会对其他影响信噪比的参数进行考察,比如说ns(采样次数)、pw(脉冲参数)等,通过一系列参数实验,选择最优参数作为实验最终方法参数。

除了实验参数对QNMR结果有影响外,稀释剂、内标物、内标峰/样品定量峰的选择也非常重要。一般来说,稀释剂大多用的是市面上常见的氘代试剂(氘代DMSO、CDCl3、CD3OD、D2O等),但是有些待测药物的溶解性质和内标物并不一致,所以需要通过一些试剂的加入,来考察共同溶解程度,例如测定索非布韦含量时,药物本身是在DMSO中有较好溶解度的,但选择的内标物在DMSO中溶解度较低,在D2O中溶解度较好,为了平衡溶解,选择了多个比例混合溶剂进行考察,最终选择了氘代DMSO-D2O(4:1)作为最终稀释剂。除了溶剂-溶剂系统外,还有些药物成盐,在酸性/碱性环境下的氘代试剂中才能很好的溶解,这也可以通过加入微量的酸/碱来调节溶解度,但是要注意水峰控制(防止过高/展宽,影响谱图基线,降低信噪比,增加后期基线处理难度)。由于液体核磁定量本身配制的溶液量很少,一般在0.4ml-1.0ml左右,pH值很难控制,且酸/碱的加入主要是为了助溶,用量相对较小(相比主溶剂系统),所以在溶液配制过程中,可以用精密称量酸/碱体积来控制酸碱度,在溶解度试验中,可以先做预耐用性实验考察。


而对于实验中内标物的选择,根据经验主要满足以下几个条件:内标物和待测物不发生反应;能和待测物在稀释剂体系下达到完全溶解;内标物方便称量,尽量不要选择液态内标(ChP建议过苯甲酸苄酯,但是实际称量起来很不方便),称量误差较大;尽量选择与待测物分子量接近的内标;内标需是国家标准品,有些磷谱/氟谱定量中,内标物选择少,可以选择一些sigma等厂家的NMR专用标准品,如果实在没有合适的标准品内标,也要在研发材料里说明原因,并在实验前对内标物进行标定。常用内标物有对苯二酚、顺丁烯二酸、盐酸吉西他滨等。


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内标峰/定量峰的选择:首先所选的内标峰和定量峰要达到完全分离,而且所选峰的信噪比S/N至少要在200(针对氢谱)以上;其次,依据药典所述应该尽量选择合适谱宽的单峰(结构中稳定氢信号峰),实际操作中,单峰很容易受卫星峰(约0.1%)干扰,谱图积分处理中会带来误差,可以对应的选择一些双峰来作为定量峰。QNMR中,可以尽量多选几组合适的峰来定量,用以增加准确度。

QNMR进行定量测定时除了依据样品分子量大小、结构复杂程度,需要选择合适分辨率的仪器外,技术人员经验也很重要,这主要影响内标法的称量准确度、匀场、谱图后处理(基线/相位校正和积分)等。

方法优化后,QNMR也要进行方法学验证,具体如何验证,这在USP中有详细描述。与HPLC等方法相近,它也是需要考察该方法的专属性、线性与范围、准确度、精密度、定量限和耐用性。几个验证项里面,也是分为含量测定和杂质测定这2个方面,针对不同测定有不同的检验标准(数据结果的RSD要求不同),几个检测项大致和HPLC方法验证相似,主要不同的是耐用性考察,QNMR中耐用性一般考察探头温度、仪器变化这2个因素即可,但如果样品在测定时,为了增加溶解度,加入了一定量的酸/碱,那就要在耐用性考察中充分考虑酸碱变化所产生的影响。



总结:

QNMR与其他传统定量方法相比,有很多优点:专属性强,无需自身对照品,不用引入校正因子,操作简捷省时间,样品用量较少。并且随着现在探头(超低温探头等)、核磁共振仪(固体核磁、高分辨液体核磁等)的技术发展,除了小分子药物体外定量,QNMR还可以越来越多的应用于大分子药物体内外定量,为生物信息学、代谢组学、新药筛选/设计等方向提供新思路。

本文章内容经授权转载于漫路药研社公众号




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